转PR蛋白基因TLP和Ace-AMP1玉米抗纹枯病的研究

【摘要】纹枯病作为玉米上的一种重要病害,严重限制了玉米的品质和产量。通过药剂防治和农业防治等方法控制纹枯病菌,不仅容易使作物产生耐药性,而且污染环境,因此利用基因工程手段培育抗病玉米新品种已逐渐成为研究的热点。病程相关蛋白(PRs)家族里的多数基因具有广谱的抗真菌特性,已广泛用于植物的转基因遗传育种。为了提高玉米对纹枯病的抵抗能力,本研究将PR-5蛋白家族中的水稻类甜蛋白TLP基因和PR-14蛋白家族的洋葱脂质转移蛋白Ace-AMP1基因用农杆菌介导法共同转入玉米中。现已获得了如下研究成果：1.构建了含目的基因的植物双价表达载体。以提取的水稻叶片总RNA为模板,通过RT-PCR克隆获得TLP基因。根据Ace-AMP1基因信号肽序列,设计两条长链引物,通过重叠延伸PCR技术获得了Ace-AMP1基因信号肽片段,并将此信号肽片段与从PET-32a(+)-Ace-AMP1植物表达载体中扩增得到的Ace-AMP1基因成熟肽片段利用重叠延伸PCR获得了最终的目的基因Ace-AMP1.将克隆得到的两个目的基因置于pCAMBIA3301表达载体上两个不同的表达框内,使TLP基因位于玉米泛素Ubi启动子下游,Ace-AMP1基因位于花椰菜花叶病毒CaMV35S基因启动子下游,成功构建了植物双价表达载体pCAMBIA3301-TLP-Ace。2.以幼胚和胚性愈伤组织为受体,将构建好的双价植物表达载体通过农杆菌介导法导入玉米品种A188和HiⅡ中,共得到了TO代转基因玉米80株,通过对目的基因采用巢式PCR检测,共获得了整合有目的基因的阳性转化株系28个。3.对PCR检测呈阳性的转基因玉米植株叶片涂抹0.01%的Basta除草剂溶液,结果显示,大多数阳性苗对除草剂有明显的抗性,涂抹区域几乎无变化,而对照非转基因玉米涂抹区域叶片明显变黄并且枯萎。4.对经PCR检测阳性且抗除草剂效果显著的再生苗离体叶片接种纹枯病菌,在接病后24h、48h和72h统计分析发病结果,发现与非转基因对照植株相比,部分转基因玉米植株发病较轻,对纹枯病表现一定的抗性。5.对TO代转化株进行自交或者姊妹交授粉,收获转基因玉米种子。
【作者】程文娟；
【导师】董五辈；
【作者基本信息】华中农业大学，植物病理学，2014，硕士
【关键词】玉米；纹枯病菌；病程相关蛋白；类甜蛋白；脂质转移蛋白；转基因；植物双价表达载体；

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